木聚糖酶活性測定方法
（規(guī)范性附錄）

A 1  方法原理
樣品的木聚糖酶對底物——燕麥木聚糖進(jìn)行水解，用DNS（3，5－二硝基水楊酸）試劑分光光度法測定水解所產(chǎn)生的還原糖量。
A 2  活性單位定義
在溫度為50℃，pH 5.3條件下，1s內(nèi)從燕麥木聚糖中產(chǎn)生1nmol木糖所需的酶量，為1個木聚糖酶的活性單位（BXU）。
A 3  應(yīng)用范圍
本法用于來源于曲霉屬（Aspergilious）或木霉屬（Trichoderma）的木聚糖酶樣品的測定。當(dāng)分析其它來源的酶時，該法的線性需要校正。本法適用于各種含有木聚糖酶的產(chǎn)品。
A 4  測定條件
A 4.1  底物：     燕麥木聚糖
A 4.2  pH：       5.3
A 4.3  溫度：     50℃±0.5℃
A 4.4  保溫時間： 5min 
A 5  儀 器
A 5.1  超級恒溫水浴鍋：50℃
A 5.2  水浴鍋： 100℃
A 5.3  旋渦磁力攪拌器
A 5.4  分光光度計：可在540nm下測定吸光度
A 5.5  分析天平：感量0.0001g
A 6  試 劑  所有試劑溶液均需用去離子水配制。
A 6.1  檸檬酸緩沖液（0.05mol/l、pH5.3）
溶解10.5g檸檬酸（C6H8O7•H2O）于800ml水中，并用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至5.3，（消耗約110ml 1mol/L氫氧化鈉），再用水定容至1000ml。
A 6.2  底物—1%燕麥木聚糖
稱取1.0g燕麥木聚糖，溶于80ml 60℃檸檬酸緩沖液中，磁力攪拌加熱至沸騰，繼續(xù)攪拌冷卻至室溫，加蓋緩慢攪拌過夜。用檸檬酸緩沖液定容至100ml。此底物溶液在4℃時最多保存一周，或?qū)⒌孜锶芤悍殖傻确菰?20℃下冰凍保存，臨用前融解，攪拌均勻使用。
A 6.3  DNS試劑
溶解50.0g 3，5二硝基水楊酸于4000ml水中，不斷磁力攪拌，緩緩加入80.0g氫氧化鈉，使之完全溶解，在繼續(xù)磁力攪拌下，將1500g酒石酸鉀鈉分?jǐn)?shù)次少量加入，并小心加熱，溶液最高溫度不超過45℃。冷卻至室溫后定容至5000ml。如溶液不澄清，用Wheatman1號濾紙過濾，然后室溫保存于深色瓶中。
A 7  樣品制備
精確稱取樣品1.0000g，置于研缽內(nèi)，加入5ml的檸檬酸緩沖液，研磨片刻，放置30min后，用檸檬酸緩沖液稀釋受檢樣品。調(diào)整稀釋倍數(shù)使測定時產(chǎn)生的吸光度在0.10～0.40之間。
A 8  測定步驟
A 8.1 試樣測定
分別向2支試管加入1.8ml底物溶液，置50℃水浴保溫5min。在其中1支試管中加入200μl稀釋酶樣，磁力旋轉(zhuǎn)攪拌均勻，置50℃水浴中，準(zhǔn)確保溫5min。分別加入3.0ml DNS試劑至2支試管中，攪拌均勻。在另一試管（空白管）中加入200μl緩沖液。同時將2支試管置入沸水浴準(zhǔn)確保溫5min，取出置入冷水中冷卻至室溫。在540nm處測量酶樣對空白的吸光度，在酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取酶活，再乘以酶樣稀釋倍數(shù)。繼續(xù)做2個重復(fù)測定。
A 8.2  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
A 8.2.1  配制10μmol/ml木糖儲備液
將150mg木糖溶解于檸檬酸緩沖液中，并用檸檬酸緩沖液定容至100ml。儲備液可分成小量在-20℃下冰凍。使用前，融解并混合均勻。
A 8.2.2  配制標(biāo)準(zhǔn)稀釋液
用緩沖液稀釋儲備液配制以下標(biāo)準(zhǔn)稀釋液：
稀釋比例 木糖(μmol/ml) 酶活(BXU/ml)
1+0 10.0 33.33
1+1 5.0 16.67
1+2 3.33 11.11
1+4 2.0 6.67
A 8.2.3  制備標(biāo)準(zhǔn)曲線
每種標(biāo)準(zhǔn)稀釋液做2次重復(fù)測定。分別向2支試管中加入1.8ml底物溶液，50℃水浴保溫5min。加入3.0mlDNS試劑和200μl標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，在沸水浴中準(zhǔn)確保溫5min，冷卻后在540nm處測量樣品對試劑空白的吸光度。以200μl檸檬酸緩沖液代替標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配制試劑空白。每批樣品制備一次標(biāo)準(zhǔn)曲線。
A 9  測定結(jié)果的計算
   
木聚糖酶活性(BXU/g) = （木糖濃度*1000*稀釋倍數(shù)）/（樣品重量*反應(yīng)時間300S）